Le peptide CLE33 réprime la différenciation du phloème via la signalisation autocrine et paracrine chez Arabidopsis

Communications Biology volume 6, Article number: 588 (2023) Citer cet article

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Les méristèmes végétaux nécessitent un apport constant de photoassimilats et d'hormones aux cellules méristématiques en division. Dans la racine en croissance, cet approvisionnement est fourni par des éléments de tamis de protophloème. En raison de sa fonction prééminente pour le méristème apical de la racine, le protophloème est le premier tissu à se différencier. Ce processus est régulé par un circuit génétique impliquant d'un côté les régulateurs positifs des facteurs de transcription DOF, OCTOPUS (OPS) et BREVIX RADIX (BRX), et de l'autre côté les régulateurs négatifs CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION RELATED (CLE) peptides et leurs récepteurs apparentés BARELY ANY MERISTEM (BAM) receptor-like kinases. Les mutants brx et ops abritent un protophloème discontinu qui peut être entièrement sauvé par mutation dans BAM3, mais qui n'est que partiellement sauvé lorsque les trois gènes CLE spécifiques au phloème connus, CLE25/26/45, sont mutés simultanément. Ici, nous identifions un gène CLE étroitement lié à CLE45, nommé CLE33. Nous montrons que le double mutant cle33cle45 supprime complètement le phénotype du protophloème brx et ops. Les orthologues de CLE33 se trouvent dans les angiospermes basaux, les monocotylédones et les eudicots, et la duplication de gènes qui a donné lieu à CLE45 chez Arabidopsis et d'autres Brassicaceae semble être un événement récent. Nous avons ainsi découvert le gène CLE d'Arabidopsis jusqu'alors non identifié qui est un acteur essentiel dans la formation du protophloème.

Dans les plantes vasculaires, les tissus du phloème transportent les sucres et les molécules de signalisation vers les organes récepteurs pour la croissance et le stockage1,2. Dans la racine d'Arabidopsis en croissance, le méristème apical de la racine est un grand puits et deux pôles du phloème, contenant des éléments de tamis fonctionnels, déchargent la sève du phloème dans la région méristématique3. Chaque pôle se compose d'un élément de tamis de protophloème, flanqué de deux cellules de péricycle de pôle de phloème de l'extérieur, et d'un élément de tamis de métaphloème de l'intérieur, et de deux cellules compagnes adjacentes à ces cellules d'élément de tamis. Cette structure complexe agit comme une unité fonctionnelle4. Remarquablement, la livraison de sucres et d'hormones au méristème racinaire est médiée uniquement par les éléments tamis du protophloème, tandis que les éléments tamis du métaphloème restent indifférenciés dans cette région de la racine5.

Le processus de formation de l'élément de tamis du protophloème nécessite des modifications cellulaires radicales, y compris le renforcement de la paroi cellulaire, l'énucléation et la formation de plaques de tamis6,7. Le contrôle génétique du développement du protophloème chez Arabidopsis a été étudié de manière intensive au cours de la dernière décennie4,6,8,9,10,11, y compris une analyse transcriptomique précise de l'ensemble du pôle du phloème4 et des éléments de tamis en développement6. La différenciation du protophloème est contrôlée par plusieurs régulateurs, tels que les gradients hormonaux, les facteurs de transcription DOF et les répresseurs transcriptionnels SMXL9,12. De plus, deux protéines localisées dans la membrane, BREVIS RADIX (BRX) et OCTOPUS (OPS) agissent comme des régulateurs positifs du développement du protophloème8,10. Les mutants de perte de fonction brx et ops présentent un protophloème discontinu, caractérisé par des cellules dites gap qui ne parviennent pas à se différencier. La continuité interrompue du protophloème entraîne une réduction de l'apport de sève du phloème au méristème apical de la racine et une croissance racinaire limitée8,10. BARELY ANY MERISTEM 3 (BAM3) a été identifié dans un crible de suppresseur brx avec bam3 sauvant à la fois la croissance des racines et les phénotypes de cellules gap de brx et ops10. BAM3 code pour une kinase de récepteur à répétition riche en leucine (LRR-RLK), un récepteur apparenté du peptide CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION 45 (CLE45)13. Bien qu'il ait récemment été démontré qu'un mutant d'ordre supérieur des gènes CLE exprimés dans le phloème (CLE25/26/45) sauve partiellement le phénotype des cellules brx et ops gap, ce sauvetage n'est pas au niveau du sauvetage complet réalisé dans bam314. Cette divergence phénotypique entre le récepteur et ses ligands suggère que des peptides CLE endogènes supplémentaires, les ligands BAM3, restent à identifier.

Les peptides CLE sont produits à partir d'un pré-propeptide d'environ 100 acides aminés qui possèdent un peptide signal dans son extrémité N-terminale pour la libération apoplastique, une région variable centrale et un domaine CLE conservé de 12 à 13 résidus dans son extrémité C-terminale, qui est clivé pour libérer le peptide CLE mature. Compte tenu de leur petite taille de gène et de leur grande variabilité de séquence en dehors du domaine CLE, l'annotation du génome des gènes CLE peut être difficile. Chez Arabidopsis, leurs découvertes provenaient initialement d'un criblage mutant15,16, suite au clonage de CLV317. La première version du génome d'Arabidopsis18 a permis l'identification de membres supplémentaires de la famille CLE en plusieurs itérations19,20,21,22,23. À ce jour, 32 gènes CLE sont annotés codant pour 27 peptides uniques. Nous avons récemment exploré la famille des gènes CLE chez la tomate et trouvé 37 nouveaux gènes CLE24, soulevant la question de savoir si des gènes CLE supplémentaires restent à découvrir chez Arabidopsis.

Nous présentons ici l'identification du gène Arabidopsis CLE33, qui a été manqué dans les analyses précédentes du génome. Nous montrons que ce gène est exprimé dans le phloème racinaire en développement et code pour un peptide actif qui agit de manière redondante avec CLE45 via le récepteur BAM3 en inhibant la différenciation du protophloème dans la lignée cellulaire du protophloème et les cellules voisines.

Pour rechercher d'autres gènes CLE d'Arabidopsis, nous avons effectué une analyse t-BLAST-n non stricte en utilisant les 32 protéines CLE de pleine longueur précédemment connues d'A. thaliana comme requêtes. Nous avons trouvé une séquence dans une région non annotée du chromosome 1 qui montre toutes les caractéristiques d'un gène CLE, y compris la présence d'un peptide signal fonctionnel. Chez d'autres espèces de Brassicaceae, ce locus génétique est conservé et est annoté comme un homologue de type CLE45 (Fig. 1a supplémentaire). Chez A. thaliana, ce locus est transcrit, confirmant l'expression du gène, que nous avons nommé CLE33 (Fig. 1b et Fig. 1b supplémentaire). Sur la base de sa séquence protéique complète, nous avons déterminé que CLE33 est l'homologue le plus proche du CLE45 bien caractérisé exprimé dans le phloème (Fig. 1a) 10,11,13.

un arbre phylogénétique des pré-propeptides CLE pleine longueur d'Arabidopsis thaliana. La ligne bleue indique le groupe exprimé dans le tissu du phloème racinaire. b Preuve de transcription basée sur Araport11 RNA-seq à partir de la couverture cartographique des semis cultivés à la lumière visualisés avec JBrowse. La position relative de la séquence codante CLE33 prédite est indiquée schématiquement : peptide signal en vert, domaine CLE en bleu. c Fusions transcriptionnelles montrant l'activité promotrice de CLE33, CLE45 et CLE26 dans le tissu du protophloème racinaire. Barre d'échelle = 50 μm.

Pour obtenir des informations sur le modèle d'expression de CLE33, nous avons cloné sa région promotrice pour piloter un rapporteur GUS (Fig. 1c supplémentaire). L'expression de CLE33 était spécifiquement associée à la vascularisation du méristème racinaire, de la jonction de la rosette et des feuilles, des cotylédons et de la tige de l'inflorescence. Pour déterminer avec précision le tissu exprimé, nous utilisons le même promoteur et deux CLE supplémentaires spécifiques au phloème (CLE26 et CLE45) pour piloter l'expression de la protéine fluorescente nucléaire NLS-Citrine (Fig. 1c et Fig. 1d supplémentaire). Dans le méristème racinaire, tous les trois sont spécifiquement exprimés dans le tissu du protophloème, mais avec de légères différences dans le début de l'expression. L'expression de CLE45 peut être observée tôt dans les cellules précurseurs de l'élément tamis, immédiatement après la première division cellulaire périclinale du précurseur procambium de l'élément tamis. L'expression de CLE33 commence quelques cellules plus tard, dans les cellules de l'élément tamis du protophloème en développement, chevauchant largement le domaine d'expression de CLE45. CLE26 est actif dans les dernières étapes de la différenciation des éléments de tamis, lorsque l'épaississement de la paroi cellulaire s'est produit, conformément aux reporters précédemment publiés25,26.

La plupart des peptides CLE induisent un arrêt de la croissance des racines lorsqu'ils sont surexprimés ou lorsqu'ils sont ajoutés au milieu de croissance à des concentrations nanomolaires et sont donc appelés root-active13,26. Pour déterminer si le peptide CLE33 pouvait également inhiber la croissance des racines primaires et quels récepteurs sont impliqués dans la perception de ce peptide dans le méristème racinaire, nous avons appliqué le peptide CLE33 à une concentration croissante de 0 à 300 nM dans le milieu de croissance et évalué l'effet d'inhibition de la croissance des racines chez les mutants du récepteur CLE de type sauvage et à perte de fonction (Fig. 2a). Chez le type sauvage, la croissance des racines a été inhibée avec 3 nM de CLE33, devenant plus prononcée avec des concentrations plus élevées. Comme pour les autres CLE actifs sur les racines connus, cette réponse était entièrement dépendante de CLV2/CORYNE13, même aux concentrations les plus élevées. En revanche, les mutants bam ont présenté une variété de réponses. bam2-4 a montré une sensibilité similaire au type sauvage, alors que bam1-3 était hypersensible au CLE33p. Cette hypersensibilité d'environ 3 fois a également été observée avec les peptides CLE26 et CLE45 (Fig. 2a, b supplémentaires) et avec le peptide CLE33 dans l'allèle bam1-4 indépendant (Fig. 2d supplémentaire). D'autre part, les mutants bam3 étaient insensibles jusqu'à 100 nM du peptide CLE33 et n'ont montré une réponse qu'à une concentration très élevée de 300 nM (Fig. 2a et Fig. 2c supplémentaire). Ce n'est qu'en combinaison avec la perte de fonction de BAM1 qu'une insensibilité totale a été obtenue, ce qui suggère que BAM1 joue un rôle dans la médiation des réponses de croissance des racines aux peptides CLE33 synthétiques à haute concentration. Pour tester davantage cette découverte dans des conditions physiologiques plus proches, nous avons utilisé le système inductible XVE-estradiol pour exprimer de manière ectopique CLE33 (Fig. 3 supplémentaire). Alors que le type sauvage a fortement réagi à l'induction ectopique de CLE33, les lignées bam3-2 sont restées insensibles même à une concentration élevée en œstradiol. Ces résultats suggèrent que les peptides CLE33 synthétiques et endogènes nécessitent BAM3 pour l'effet d'inhibition de la croissance des racines.

a Inhibition de la croissance des racines dose-dépendante par CLE33p chez les mutants du récepteur de type sauvage et CLE. b Inhibition de la croissance des racines avec les peptides synthétiques CLE33 (30 nM), CLE45 (30 nM), CLE26 (3 nM). c Inhibition de la croissance des racines des variants du peptide CLE33 CLE33M2K, CLE33G4P, CLE33S7P (30 nM). a–c Les lettres indiquent différents groupes statistiques (ANOVA, test de Tukey post hoc).

BAM3 s'est avéré être le récepteur apparenté du peptide 13 CLE45, et les mutants bam3 présentent une insensibilité similaire aux peptides CLE33 et CLE45 (Fig. 2b et Fig. 2a supplémentaire). Cette dépendance BAM3 unique est très spécifique aux peptides CLE33 et CLE45, mais pas au peptide CLE26 étroitement apparenté (Fig. 2b supplémentaire). En comparant les séquences d'acides aminés de ces trois peptides, nous avons remarqué que les prolines conservées aux positions 4 et 7 sont remplacées dans CLE33 par la glycine et la sérine, et dans CLE45 par l'arginine et la sérine (Fig. 2b). Pour étudier plus avant l'importance de ces acides aminés pour la spécificité des récepteurs, nous avons créé et testé des variantes de CLE26 et CLE33 en échangeant des résidus entre ces deux peptides. Tout d'abord, nous avons observé que toutes les variantes peptidiques (CLE26P4G, CLE26P7S, CLE26P4G / P7S, CLE33M2K, CLE33G4P, CLE33S7P) avaient un fort effet d'inhibition de la croissance des racines chez le type sauvage mais largement aucun effet chez le mutant crn-10, ce qui implique que les substitutions d'acides aminés n'affectent pas leur capacité à supprimer la croissance des racines (Fig. 2c et Fig. 4 supplémentaire). Cependant, la dépendance à BAM3 reposait fortement sur les résidus aux positions 4 et 7. La présence d'une proline en position 4 ou 7 dans CLE33 a conduit à une réponse indépendante de BAM3 (Fig. 2c), et inversement les deux prolines devaient être remplacées dans CLE26 pour ne pas inhiber la croissance des racines chez le mutant bam3 (Fig. 4 supplémentaire). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que l'absence de prolines en position 4 et 7 détermine la spécificité de perception BAM3 des peptides CLE33 et CLE45.

Il a déjà été démontré que le développement du protophloème racinaire est inhibé par les peptides CLE actifs sur les racines ajoutés au milieu de croissance13. Pour tester l'effet de CLE33 sur l'identité du protophloème, nous avons évalué l'expression du marqueur de protophloème pCVP2: NLS-3xVenus lors du traitement d'une nuit du peptide CLE33 (Fig. 5 supplémentaire). L'effet inhibiteur de CLE33 sur l'identité du protophloème était similaire à l'effet de CLE26 et CLE45, suggérant que CLE33 agit comme un régulateur négatif de la différenciation du protophloème.

Pour comprendre la fonction biologique de CLE33 in planta et sa relation génétique avec CLE45, nous avons créé des mutants knock-out médiés par CRISPR-Cas9 dans des contextes de type sauvage et cle45-2 (Fig. 6 supplémentaire). Comme bam3¸, les mutants simples cle33 et doubles cle33cle45 ne présentent aucun macro-phénotype reproductible de croissance des racines dans nos conditions (Fig. 3 et Fig. 7 supplémentaire). Conformément aux rapports précédents, les mutants de perte de fonction BAM3 peuvent pleinement sauver la différenciation discontinue du protophloème de brx et ops8,10, ce qui n'est pas le cas pour cle4514. Nous avons demandé si cette divergence phénotypique pouvait être attribuée à la présence du CLE33 restant dans le tissu du protophloème. Pour approfondir cela, nous avons croisé le double mutant cle33-3 cle45-2 avec brx-3 et ops-2. La mutation dans CLE33 seule n'a eu aucun ou très peu d'impact sur le sauvetage de la croissance des racines et la continuité du protophloème de brx-3 et ops-2 (Fig. 3 et Fig. 7 supplémentaire). Nous avons pu reproduire un résultat publié précédemment, où cle45 a partiellement supprimé le phénotype de croissance des racines mais n'a pas réussi à réduire de manière significative la fréquence des cellules de l'écart du protophloème14. La combinaison de cle33 et cle45 pourrait pleinement sauver les phénotypes de croissance des racines et de discontinuité du protophloème, suggérant fortement que CLE33 et CLE45 agissent de manière redondante dans ce circuit génétique (Fig. 3 et Fig. 7 supplémentaire). Ces résultats pris ensemble soutiennent un rôle négatif pour CLE33 dans la différenciation du protophloème.

a Longueur des racines à 10 jours après la germination. Les lettres indiquent un groupe statistique différent (ANOVA, test de Tukey post hoc). b Images confocales représentatives de racines colorées en blanc calcofluor. Les flèches rouges indiquent les cellules de l'écart du protophloème. Les barres d'échelle correspondent à 100 μm. c Quantification de la fréquence des cellules d'écart. Les lettres indiquent les groupes statistiques (test χ2 avec correction de Benjamini-Hochberg).

L'échec du développement du protophloème causé par la perte de fonction de BRX ou d'OPS pourrait s'expliquer par des doses élevées du récepteur BAM3 ou des ligands CLE spécifiques du phloème. Pour tester cette possibilité, nous avons quantifié l'accumulation de transcrits dans les tissus racinaires brx et ops. Nous avons constaté qu'au niveau transcriptionnel, BAM3 n'est pas régulé à la hausse et que CLE25, CLE26 et CLE45 ont même montré une réduction significative de leur expression (Fig. 8a supplémentaire), ce qui suggère que l'augmentation de la signalisation médiée par BAM3/CLE33/45 chez les mutants brx et ops est causée par un autre mécanisme.

Lors de l'analyse de la continuité du protophloème, nous avons rencontré un phénotype supplémentaire de cellules ectopiques de type élément de tamis provenant des cellules voisines adjacentes au fichier cellulaire principal de l'élément de tamis du protophloème. Ces fichiers cellulaires montrent les caractéristiques des éléments de tamis en développement, y compris l'épaississement de la paroi cellulaire (Fig. 4a). Un phénotype apparenté a récemment été montré dans les multiples mutants de perte de fonction dans les CLE du phloème, le récepteur BAM et les mutants du co-récepteur CIK, ce qui a démontré que la signalisation CLE empêche les cellules voisines de se différencier en éléments tamis9. Cette analyse précédente a été effectuée à un stade ultérieur du développement du phloème lorsque les éléments de tamis du protophloème et les éléments de tamis du métaphloème se sont différenciés et possèdent des parois cellulaires épaisses9. Dans nos analyses, nous nous sommes concentrés sur la zone méristématique. Nous avons quantifié la fréquence des événements de différenciation du protophloème ectopique chez nos mutants. Nous avons trouvé une différenciation ectopique accrue en l'absence de BAM3 et dans les triples mutants cle33 cle45 brx et cle33 cle45 ops, mais pas dans les combinaisons de doubles mutants (Fig. 4b et Supplémentaire Fig. 8b). Cette différence pourrait être due à une identité plus faible du phloème en l'absence de brx et d'ops, et / ou à des niveaux réduits de CLE25 / CLE26 dans ces milieux (Fig. 8a supplémentaire) qui sont connus pour réprimer la formation d'éléments de tamis ectopique9. Néanmoins, les résultats de notre analyse montrent que CLE33 et CLE45 agissent de manière redondante en inhibant la formation des éléments de tamis du protophloème ectopique (Fig. 4c et Fig. 7 supplémentaire).

a Images confocales de racines colorées en blanc calcofluor. Les flèches bleues indiquent les fichiers cellulaires montrant un renforcement de la paroi cellulaire, signe qu'ils subissent un processus de différenciation du protophloème. Les barres d'échelle correspondent à 50 μm. b Fréquence de la différenciation ectopique du protophloème dans les racines. Les lettres indiquent les groupes statistiques (test χ2 avec correction de Benjamini-Hochberg). c Modèle schématique de la signalisation autocrine et paracrine médiée par les peptides CLE33/45 via le récepteur BAM3.

Il a été récemment démontré que CLE25, CLE26 et CLE45 ont des sites de liaison du facteur de transcription DOF dans leur région promotrice et sont induits par DOF2.29. Notre analyse de la région promotrice CLE33 a révélé des sites de liaison similaires pour DOF2.2, DOF2.4/PEAR1, DOF3.2, OBP3, DOF5.1/PEAR2 et DOF5.6 (Fig. 8c supplémentaire). Ce résultat suggère que CLE33 peut être un acteur essentiel dans le circuit génétique DOF-CLE.

Les deux gènes codant pour les peptides, CLE33 et CLE45, semblent être fonctionnellement redondants (figures 3 et 4) et partagent une grande similitude de séquence et de modèle d'expression (figure 1). Par conséquent, ils pourraient être le résultat d'un événement de duplication de gène. Pour en savoir plus sur leur origine évolutive, nous avons effectué une analyse phylogénétique sur diverses espèces de plantes vasculaires. Nous avons identifié des orthologues de CLE33 dans les génomes des angiospermes basaux, des monocotylédones et des eudicots, mais pas des gymnospermes, ce qui suggère qu'il est apparu il y a environ 200 millions d'années (Fig. 9a supplémentaire). Fait intéressant, des orthologues clairs de CLE45 n'ont été trouvés que chez les espèces de Brassicales. Un alignement multi-séquence a révélé que Brassicales CLE45 avait une région variable étendue sans homologie avec d'autres protéines de type CLE33/45 dans la partie N-terminale immédiatement après le peptide signal (Fig. 9b supplémentaire). Cependant, lors de l'analyse spécifique du domaine CLE, nous avons observé que CLE45 est plus similaire aux orthologues ancestraux de CLE33 (Fig. 9c supplémentaire). Une possibilité pour une telle occurrence est qu'à la suite d'une duplication chez les premiers Brassicales, une copie a rapidement dérivé génétiquement dans sa région variable donnant naissance au CLE45 actuel. Dans un tel scénario, Brassicales CLE33 a conservé la majeure partie de la séquence ancestrale, à l'exception des résidus 2/3/4 dans son domaine CLE. De manière frappante, tous les orthologues de CLE33 et de CLE45 n'ont pas de prolines aux positions 4 et 7, ce que nous avons trouvé important pour la spécificité de la perception des récepteurs chez Arabidopsis (Fig. 2).

De plus, nous avons étudié l'origine évolutive de BAM3, le gène codant pour le récepteur percevant ces deux ligands. Nous avons trouvé des orthologues présents jusqu'aux gymnospermes (Fig. 10 supplémentaire). Une duplication précoce dans les angiospermes a produit deux copies : BAM3 et BAM4. Alors que BAM3 se trouve dans tous les groupes d'angiospermes, BAM4 est particulièrement absent des génomes des espèces de Brassicaceae. La perte de BAM4 coïncide avec l'émergence de CLE45 chez Brassicales. Pourtant, les ligands de BAM4 et leurs fonctions restent inconnus. Nos découvertes ouvrent de nouvelles directions pour une exploration plus approfondie de ces paires récepteur-ligand et de leur fonction potentiellement conservée tout au long de l'évolution des plantes.

Ces dernières années, de nombreux gènes supplémentaires codant pour des ligands peptidiques ont été découverts chez Arabidopsis et d'autres espèces végétales24,27,28,29,30,31. Ceux-ci appartiennent à des familles jusque-là inconnues, telles que les peptides CTNIPs/SCREWs induits par le stress27,28, ou à des familles de gènes bien caractérisées, telles que CIF/TWS131 et CLE dans notre étude. Il semble que les annotations du génome des plantes, y compris Arabidopsis, manquent encore de nombreux gènes codant pour des peptides. Cependant, des méthodes avancées telles que le profilage des ribosomes combiné à la transcriptomique et à la peptidomique32,33 ont montré un grand succès dans l'identification de quelques milliers de ces gènes chez Medicago32 et le maïs33. De plus, les analyses à l'échelle du génome à l'aide de modèles de Markov cachés34 ont conduit à l'identification de nouveaux peptides24,35. Grâce à ces méthodes avancées, nous serons bientôt en mesure d'obtenir un répertoire complet de peptides de signalisation végétaux régulant une myriade de réponses développementales et adaptatives.

Dans notre étude, nous avons effectué une recherche t-BLAST-n non stricte des gènes CLE, ce qui nous a permis d'identifier le CLE33 précédemment non annoté. Les prolines aux positions 4 et 7 sont parmi les acides aminés les plus conservés dans les peptides CLE, et leur absence dans CLE33/45 en fait des exceptions et explique en partie pourquoi ces gènes ont été identifiés plus tard22. D'un point de vue structurel, le résidu de proline confère des changements conformationnels uniques en raison de sa géométrie irrégulière36. La chaîne latérale de la proline est connectée deux fois au squelette peptidique, créant sa propre structure secondaire. On sait peu de choses sur la contribution des prolines aux interactions avec les surfaces de liaison du récepteur CLE et du co-récepteur. Cependant, il a été montré que dans les peptides CLE matures, les prolines 4 et 7 subissent une hydroxylation et l'une ou l'autre ou les deux subissent une glycosylation avec 3, 4 ou 6 résidus d'arabinose37. Il a été démontré que l'hydroxyproline en position 4 dans le peptide CLE40 empêche le mauvais clivage du peptide précurseur38. Dans le même temps, l'absence ou la présence d'hydroxylation dans le peptide CLE40 mature et la substitution de la proline en position 4 par l'alanine (P4A) n'ont pas affecté la bioactivité du peptide dans les tests de croissance racinaire38. De plus, le remplacement des hydroxyprolines en positions 4 et 7 par des prolines dans CLE9 n'a pas affecté l'affinité de liaison à BAM1 in vitro39, ce qui aurait pu suggérer que la proline 4 elle-même et l'hydroxylation de la proline ne sont pas essentielles à l'interaction peptide-récepteur38,39. Cependant, nos tests de bioactivité avec des peptides CLE26 et CLE33 modifiés indiquent que les prolines aux positions 4 et 7 sont des déterminants de la spécificité des récepteurs. Il a été démontré que dans BAM3, les résidus Q226Y228Y231 sont cruciaux pour la liaison de CLE4513, mais comment l'absence de prolines 4 et 7 contribue à la liaison spécifique avec BAM3 doit être clarifiée.

L'émergence d'éléments de tamis conducteurs de sucre hautement spécialisés a été une étape cruciale dans l'évolution des plantes terrestres. Cette invention a facilité la séparation des organes photosynthétiques qui doivent rivaliser pour la lumière et se développer vers le soleil, et des organes absorbant l'eau qui poussent profondément dans le sol. Des fichiers d'éléments de tamis primitifs peuvent être trouvés dans les espèces d'algues brunes et les mousses40, ne montrant souvent qu'une dégradation et une énucléation partielles des protoplastes. Toutes les plantes vasculaires non florifères, y compris les gymnospermes, possèdent des cellules criblées, qui ont des zones criblées et non des plaques criblées sur les parois latérales et d'extrémité41. Chez les gymnospermes, les cellules de tamis conductrices manquent de cellules compagnes adjacentes et ont la forme de structures allongées en forme de fuseau qui sont reliées axialement et latéralement par des zones de tamis avec des pores de tamis étroits, ce qui entraîne une résistance à l'écoulement plus élevée et des vitesses de transport plus lentes. Les angiospermes développent des éléments de tamis de phloème isolés très efficaces avec des plaques de tamis sur les parois d'extrémité, ce qui facilite le transport rapide des photoassimilats41,42. Ici, nous avons identifié un nouvel acteur moléculaire dans la formation du protophloème racinaire, un petit gène de peptide de signalisation CLE33. Dans la racine d'Arabidopsis, les facteurs de transcription DOF spécifiques au phloème induisent un ensemble de régulateurs positifs du développement du phloème et des CLE, qui régulent à la baisse l'expression du DOF dans une boucle de rétroaction9,12. Avec des sites de liaison DOF dans sa séquence régulatrice en amont, CLE33 est probablement impliqué dans ce circuit génétique. Nous avons démontré que CLE33 agit de concert avec CLE45 pour contrecarrer la différenciation des éléments tamis médiée par BRX/OPS. Un tel mécanisme peut potentiellement jouer un rôle dans la définition du bon moment pour la différenciation de l'élément tamis en fonction des signaux endogènes et des conditions environnementales. En outre, nous montrons que CLE33 agit de manière redondante avec CLE45 pour empêcher les cellules voisines du protophloème de se différencier en éléments de tamis. Ces résultats suggèrent que CLE33/45 agissent à la fois comme signaux autocrines et paracrines, alors que les deux autres gènes CLE du phloème (CLE25 et CLE26) ont un rôle limité en tant que signaux autocrines dans le module BRX/OPS-BAM3 régulant la différenciation du protophloème. Autre acteur de cette voie, le RECEPTOR PROTEIN LIKE KINASE 2 (RPK2) s'est récemment révélé impliqué dans la différenciation du protophloème43. Le mutant rpk2 à perte de fonction a pu sauver partiellement les phénotypes d'écart du protophloème et la croissance des racines des mutants brx, ops ou cvp2cvl143. Il a été montré que RPK2 interagit génétiquement avec BAM1 et que les deux protéines forment des complexes hétéromères44, mais l'interaction possible de RPK2 avec BAM3 n'est pas encore explorée.

La capacité de l'élément tamis du protophloème entourant les cellules à se développer en cellules de l'élément tamis est importante pour la plasticité développementale de ce tissu43. L'ablation au laser du protophloème en développement déclenche la différenciation des cellules voisines43, contournant le protophloème original interrompu pour maintenir l'apport de sucres et d'hormones au méristème. Il semble que le bon équilibre entre la suppression et le maintien du potentiel de différenciation en éléments tamis en cas d'échec soit essentiel pour la fonction du protophloème. Il reste à savoir pourquoi le maintien d'un seul fichier d'éléments tamis fonctionnels a un contrôle génétique aussi strict.

Chez les plantes vasculaires supérieures, la voie CLAVATA a été largement étendue à la fois par le nombre de gènes de peptides CLE, ainsi que par de nouveaux composants des complexes récepteurs, notamment des duplications de RLK de type CLV1/BAM et l'apparition de la protéine de type récepteur CLAVATA2 et de la pseudo-kinase CORYNE45. Avec les orthologues CLE33 trouvés dans les angiospermes basaux, il est possible qu'au cours de l'évolution de la plante, les CLE exprimés par le phloème aient été recrutés pour façonner le tissu unique du phloème des angiospermes qui fonctionne efficacement dans la translocation rapide des photoassimilats.

Une recherche t-BLAST-n dans le génome d'A. thaliana dans la base de données EnsemblPlant a été menée en utilisant la protéine CLE pleine longueur 32 précédemment connue d'A. thaliana comme requêtes. Pour obtenir plus de résultats, le seuil de valeur e a été défini sur 10 au lieu du paramètre d'origine de 10−1. Les séquences candidates qui n'ont pas été annotées en tant que gènes CLE ont été comparées manuellement aux requêtes. Seules les séquences similaires au domaine CLE ont été analysées plus avant pour la présence d'un peptide signal, preuve d'expression, et ne faisant pas partie d'une autre protéine décrite. Après filtrage, une seule séquence dans une région non annotée du chromosome 1 est restée et possédait toutes les caractéristiques d'un gène CLE : CLE33.

Tous les mutants décrits dans cette étude sont dans le fond Arabidopsis thaliana Columbia-0 (Col-0) : clv2-113 crn-1013, bam1-3 (SALK_015302), bam1-4 (SALK_107290), bam2-4 (SAIL_1053_E09), bam3-2 (SALK_044433)13, bam3-3 (SALK_1 18860), bam1-4 bam3-3, bam2-4 bam3-2, cle45-246, brx-347, ops-2 (SALK_139316)8.

Les mutants de perte de fonction dans CLE33 ont été générés par l'édition du gène de base CRISPR-Cas9. La conception d'ARN-guides à faible hors cible a été réalisée à l'aide de CCTop (10.1371/journal.pone.0124633). La génération de l'ARNg a été réalisée par hybridation de dimère d'amorce (C67xC68; C69xC70) et clonée dans le vecteur de destination pAGM5526148 par ligature coupée BsaI. A. thaliana Col-0 de type sauvage et cle45-2 ont été transformés par un bain floral dans une suspension d'Agrobacterium tumefaciens. Les graines transgéniques ont été criblées pour la fluorescence DsRed. Les mutations générant un décalage de cadre dans CLE33 ont été recherchées dans la descendance non transgénique. Des mutants d'ordre supérieur ont été obtenus par croisement.

Les gènes et les régions promotrices ont été amplifiés par Phusion PCR avec les amorces indiquées dans le tableau supplémentaire 1. Les plasmides ont été construits comme indiqué dans le tableau supplémentaire 2 par l'assemblage modulaire Golden Gate49.

Les homologues CLE33/CLE45 et BAM3 ont été recherchés par BLASTP dans les bases de données Phytozome13 et PLAZA Gymnosperm. Aucun indice n'a été trouvé dans Carica papaya, et un t-BLAST-n a été effectué pour trouver les homologues CLE33/45. Les séquences CLE de tomate ont été extraites de24. Les séquences protéiques complètes ont été alignées à l'aide de MUSCLE et conservées manuellement dans MEGA-X50 pour la Fig. 1a, ou MAFFT avec DASH activé51 pour les Figs supplémentaires. S9 et S10. Les alignements ont été utilisés pour produire des arbres avec 1000 réplicats bootstrap avec IQTREE52 et visualisés avec iTOL53. L'analyse de la synténie du CLE33 chez les Brassicaceae a été réalisée avec le Genome Context Viewer54. Des profils d'alignement multi-séquences ont été composés avec alignementviewer.org55. Les logos de conservation des séquences ont été générés par WebLogo56.

Les graines ont été placées sur des plaques MS à 1 % de sucre à demi-force complétées ou non avec la concentration indiquée de peptides (Genescript, pureté > 75 %, dissous dans l'eau) ou d'œstradiol (la solution mère a été diluée dans du DMSO) ou du solvant correspondant, et conservées dans l'obscurité à 4 °C pendant 48 h avant d'être transférées dans une chambre de croissance à 22 °C avec des cycles de 16 h de lumière/8 h d'obscurité. Les semis ont été cultivés pendant 7 jours pour les essais d'inhibition de la croissance des racines par des peptides, ou 10 jours pour la suppression génétique des phénotypes de croissance des racines brx-3/ops-2. Après avoir numérisé les plaques avec un scanner Epson à haute résolution (600 dpi), la longueur des racines a été mesurée à l'aide de l'outil traceur à neurite unique à Fidji.

La région promotrice de CLE33 (876 pb à partir du codon d'initiation) a été clonée pour piloter l'expression du système rapporteur GUS. Les semis transgéniques ont été incubés à 37 ° C dans un tampon de coloration GUS (0, 5 mg / ml X-Gluc, tampon phosphate 100 mM, EDTA 10 mM, ferricyanure de potassium 1 mM, ferrocyanure de potassium 1 mM, 0, 1% Triton X-100) et éliminés dans 70% d'éthanol. Les images ont été prises à l'aide du microscope Zeiss Axioplan et du stéréomicroscope Leica MDG36.

Pour l'analyse de l'expression spécifique aux cellules, les régions en amont de CLE26 (1615 pb), CLE45 (2513 pb) et CLE33 (876 pb) ont été clonées et utilisées pour piloter l'expression de la fusion localisée nucléaire consistant en H2B ou NLS et Citrine. Pour le traitement peptidique, des semis transgéniques homozygotes pCVP2:NLS-3xVenus ont été transférés dans les plaques fraîches ne contenant pas de peptide, ou 100 nM de CLE33p ou CLE45p, 22 h avant la fixation.

Les plantules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% (Sigma) dans du PBS pendant 1h minimum. Après lavage avec du PBS, les échantillons ont été colorés pendant une nuit avec un Calcofluor White à 0,2 % dissous dans une solution ClearSee57, et clarifiés avec ClearSee pendant au moins 48 h. L'imagerie a été réalisée à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser Leica TCS SP5 avec les paramètres suivants : paroi cellulaire colorée au calcofluor (excitation à 405 nm, détection à 415–500 nm), Vénus ou Citrine (excitation à 514 nm, détection à 522–574 nm ou 524–600 nm).

Les feuilles de N. bethamiana ont été transitoirement transformées par infiltration avec A. tumefaciens portant un plasmide multicassette exprimant pUbi:CLE33-mCherry et p35s:Venus. Après 3 jours, les disques foliaires ont été imagés séquentiellement avec un microscope confocal à balayage laser Leica TCS SP5 pour Vénus (émission à 514 nm, détection de 524 à 551 nm) et mCherry (émission à 561 nm, détection de 571 à 650 nm).

Des semis âgés de cinq jours ont été transférés dans de nouvelles plaques contenant 1 µM d'estradiol ou la quantité équivalente de solvant (DMSO). Après 16 heures, les plantules ont été congelées par choc dans de l'azote liquide. Les échantillons congelés ont été broyés dans un broyeur avec des billes métalliques. L'ARN a été extrait à l'aide du kit MagMAX Plant RNA Isolation (Applied Biosystems). L'ADN restant a été éliminé par précipitation au LiCl 2 M. La synthèse d'ADNc a été réalisée à l'aide du kit de synthèse d'ADNc SensiFAST (Meridian). Des PCR quantitatives ont été réalisées avec Fast Start Universal SYBR-green Master (Roche), avec les amorces du tableau supplémentaire 1. Les conditions du cycleur thermique (Mic qPCR Cycler, systèmes biomoléculaires) étaient : 95 °C 2 min, 45 cycles de 95 °C 15 s, 58 °C 10 s, 60 °C 50 s, suivis d'une analyse de la courbe de dissociation. Les valeurs d'expression ont été normalisées à l'actine.

Nous avons effectué des analyses statistiques en utilisant R v4.0.2 dans l'interface Rstudio. Nous avons utilisé la transformation logarithmique pour la longueur des racines et l'identité des cellules du protophloème QC. La signification statistique a été déterminée par ANOVA suivie d'un test de Tukey post hoc pour la comparaison multiple. Pour la fréquence des cellules d'écart, nous avons utilisé un test χ2 avec une correction de la valeur P de Benjamini-Hochberg. En général, la taille de l'échantillon a été choisie en fonction de la variabilité observée dans les expériences préliminaires. Pour les essais impliquant des semis cultivés sur des plaques, plusieurs plaques par conditions ont été utilisées pour limiter la variabilité de l'effet de plaque. Nous avons effectué un test de croissance des racines et une analyse du protophloème racinaire au moins deux fois avec des résultats similaires. Le modèle d'expression de CLE33 a été dérivé de plus d'une douzaine de lignées rapporteurs transcriptionnelles T1. L'analyse de l'expression par qPCR a été réalisée une fois avec quatre répétitions techniques.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Des ensembles de données supplémentaires soutenant cette étude ont été soumis à Dryad et peuvent être trouvés en utilisant ce lien : https://doi.org/10.5061/dryad.x69p8cznw. Ces ensembles de données incluent les données sources numériques pour les graphiques et les diagrammes qui peuvent être trouvés dans le fichier Excel, les images confocales originales aux formats lif et lsm et les alignements de gènes au format fas. Toutes les données supplémentaires sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions le Dr Bojan Gujas pour le partage de la lignée transgénique (pCVP2:NLS-Venus) et des conseils techniques pour la microscopie du phloème. Nous remercions la Bioimage Core Facility de l'Université de Fribourg et la Adolphe Merkel Imaging Facility. Ce travail a été financé par Ambizione SNSF Grant (PZ00P3_179745) à OH, COST SNSF Grant (IZCOZ0_189892) à OH et un financement supplémentaire fourni par l'Université de Fribourg à OH

Département de biologie, Université de Fribourg, Chemin du Musée 10, 1700, Fribourg, Suisse

Samy Carbonnel, Salves Cornelis & Ora Hazak

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Cicatrice. et la recherche conçue par OH ; Cicatrice. et S.Cor. effectué des recherches ; S.Car a analysé les données et préparé des chiffres ; OH a écrit le premier brouillon; OH, S.Car. et S.Cor. ensemble édité le manuscrit ; Projet supervisé par OH ; OH a obtenu un financement.

Correspondance à Ora Hazak.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Ce manuscrit a déjà été évalué dans une autre revue Nature Portfolio. Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la gestion principale : David Favero.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Carbonnel, S., Cornelis, S. & Hazak, O. Le peptide CLE33 réprime la différenciation du phloème via la signalisation autocrine et paracrine chez Arabidopsis. Commun Biol 6, 588 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04972-2

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Reçu : 13 avril 2023

Accepté : 23 mai 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04972-2

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